【目的和要求】
1．掌握無菌技術(shù)，建立無菌觀念；明確無菌操作時(shí)注意要點(diǎn)。
2．掌握**的接種、分離培養(yǎng)方法和接種環(huán)的制作方法。
3．熟悉**生長現(xiàn)象的觀察方法。
【試劑與器材】
1．菌種：葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌等。
2．培養(yǎng)基：固體、半固體、液體培養(yǎng)基。
3．其他：溫箱、酒精燈、接種環(huán)、接種針、L形玻棒、打火機(jī)、記號(hào)筆等。
【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】
一、**的接種工具
1．接種環(huán)和接種針：其結(jié)構(gòu)包括環(huán)（針）、金屬柄、絕緣柄三部分（見圖4-1）。其中環(huán)（針）部分*佳材料為白金絲，因其受熱和散熱速度快，硬度適宜，不易生銹且經(jīng)久耐用，但因?yàn)閮r(jià)格昂貴而限制了其應(yīng)用。目前實(shí)驗(yàn)室常用的是經(jīng)濟(jì)實(shí)用的300~500W電熱鎳鉻絲。一般要求接種環(huán)長5~8cm，直徑為2~4mm，定量接種環(huán)的容量為0.001ml。
圖4-1 接種環(huán)和接種針
接種環(huán)（針）在使用之前需檢查鎳鉻絲是否呈直線，若有彎曲，需用吸管或接種環(huán)的另一端將其壓直；若環(huán)不圓，可將鎳鉻絲前端放在吸管尖部纏繞一圈，再將鎳鉻絲突出的部分朝內(nèi)壓緊。
接種環(huán)用于固體、液體培養(yǎng)基的接種，接種針用于半固體培養(yǎng)基的接種。
2．L形玻棒：由直徑2~3mm的玻璃棒彎曲成L形制成。在使用之前用厚紙包扎后置高壓蒸汽**，或沾取無水乙醇后在火焰上燒灼**。主要用于液體標(biāo)本涂布接種。
二、**的接種方法
1．液體培養(yǎng)基的接種
該法主要用于**的增菌培養(yǎng)或進(jìn)行**的生化反應(yīng)。
方法：（圖4-2）
（1）先將接種環(huán)在火焰上燒灼**，待冷卻后挑取少許**。
（2）左手拿試管，右手持接種環(huán)，用右手其余手指將試管塞打開，試管口通過火焰燒灼**。
（3）將接種環(huán)在貼近液面的管壁上上下碾磨數(shù)次，使**均勻分布于培養(yǎng)基中。
（4）將試管口**后加塞，接種環(huán)燒灼**后放回原處。
（5）在試管上做好標(biāo)記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。
圖4-2 液體培養(yǎng)基接種法
2．半固體培養(yǎng)基的接種
該法可用于保存菌種、觀察**的動(dòng)力或進(jìn)行**的生化反應(yīng)。
方法：（圖4-3）
（1）先將接種針在火焰上燒灼**，待冷卻后挑取少許菌落。
（2）左手拿試管，右手持接種針，將試管塞打開后，試管口通過火焰**，將接種針從培養(yǎng)基的中心向下垂直穿刺接種至試管底上方約5mm處（勿穿至管底），然后由原穿刺線退出，
（3）將試管口**后加塞，接種針燒灼**后放回原處。
（4）在試管上做好標(biāo)記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。
圖4-3 半固體培養(yǎng)基接種法
3．平板劃線接種法
該法可將標(biāo)本中的多種**分散成單個(gè)菌落，有利于**的分純和進(jìn)一步鑒定。
方法：
（1）連續(xù)劃線法（圖4-4）
1）先將接種環(huán)在火焰上燒灼**，待冷卻后挑取少許菌落。
2）左手斜持平板，用手掌托著平板底部，五指固定平板邊緣，在酒精燈旁以拇指、食指和中指將平板蓋撐開大約30~45°角，將已挑取**的接種環(huán)先在平板一側(cè)邊緣均勻涂布，然后運(yùn)用腕力將接種環(huán)在平板上自上而下，來回劃線。劃線要密，但不能重疊，充分利用平板的面積，不能劃破瓊脂表面，并注意無菌操作，避免空氣中的**污染。
3）劃線完畢，將平板扣入平板蓋，接種環(huán)燒灼**后放回原處。
4）在平板底上做好標(biāo)記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。
圖4-4 固體培養(yǎng)基連續(xù)劃線法
（2）分區(qū)劃線法（圖4-5）
1）先將接種環(huán)在火焰上燒灼**，待冷卻后挑取少許菌落。
2）同上法將平板蓋打開約30~45°角，將已挑取**的接種環(huán)在平板一端（1區(qū)）內(nèi)作來回劃線，再在2、3、4區(qū)依次劃線，每區(qū)的劃線須有數(shù)條線與上區(qū)交叉接觸，每劃完一區(qū)是否需要燒灼接種環(huán)依標(biāo)本中的菌量多少而定，每區(qū)線間需保持一定距離，線條要密而不重復(fù)。
3）劃線完畢，將平板扣入平板蓋，接種環(huán)燒灼**后放回原處。
4）在平板底上做好標(biāo)記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。
圖4-5 固體培養(yǎng)基分區(qū)劃線法
4．斜面培養(yǎng)基接種法（圖4-6）
斜面培養(yǎng)基主要用于**的純培養(yǎng)，以進(jìn)一步鑒定**或保存菌種。
（1）將接種環(huán)（或接種針）在火焰上燒灼**，待冷卻后以無菌操作挑取少許菌落。
（2）左手拿試管，打開試管塞后，試管口通過火焰**，再將取有**的接種環(huán)由斜面底部向上劃一直線，再由下至上在斜面上作曲線劃線。
（3）試管口**后加塞，接種環(huán)燒灼**后放回原處。
（4）在試管上做好標(biāo)記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。
圖4-6 斜面培養(yǎng)基接種法
5．涂布接種法
本法主要用于活菌計(jì)數(shù)和藥敏試驗(yàn)。
（1）活菌計(jì)數(shù)：取一定稀釋度的菌液0.1ml滴在平板上，用無菌L型玻璃棒將液滴涂布均勻，蓋上平板蓋，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后計(jì)數(shù)菌落，則每毫升所含活菌數(shù)=菌落數(shù)×10×稀釋倍數(shù)。
（2）直接涂布法：多用于紙片法和管碟法藥敏試驗(yàn)。先配制一定濃度的菌液，用無菌棉簽蘸取菌液后，在管壁上將多余的液體擠去，在MH瓊脂平板上按三個(gè)方向均勻涂布3次，*后沿平板邊緣涂一周。蓋上平板蓋，置室溫放置5min使平板表面稍干，然后用無菌鑷子將藥敏紙片貼在培養(yǎng)基表面，或向豎在平板表面的牛津小杯內(nèi)加入不同濃度的**，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果，測定抑菌圈直徑，按判斷標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。
6．傾注培養(yǎng)法
此法常用于標(biāo)本或樣品中活菌計(jì)數(shù)。
（1）方法：
1）將標(biāo)本用無菌生理鹽水稀釋成不同濃度：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等。
2）取不同稀釋度的標(biāo)本各1ml分別注入直徑90mm無菌平皿，迅速加入溶化并冷卻至約50℃的營養(yǎng)瓊脂15ml，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)平板使之充分混勻，待凝固后翻轉(zhuǎn)平板。
3）置35℃溫箱孵育18~24h，計(jì)數(shù)菌落形成單位（colony forming unit，CFU），按下式算出每ml標(biāo)本中的**數(shù)：
1ml標(biāo)本中的活菌數(shù)=全平板CFU×稀釋倍數(shù)
7．**接種的注意事項(xiàng)
（1）**接種過程中需注意無菌操作，避免污染，因此每一步操作均需嚴(yán)格按要求進(jìn)行。操作時(shí)不宜說話或?qū)⒖诒强拷囵B(yǎng)基表面，以免呼吸道排出的**污染培養(yǎng)基。
（2）所有操作均需在酒精燈火焰附近進(jìn)行，平皿蓋、試管塞、瓶塞均應(yīng)拿在手上打開（具體見前述），禁止將蓋或塞事先取下放置在桌面上。
（3）取菌種前灼燒接種針（環(huán)）時(shí)要將鎳鉻絲燒紅，燒紅的接種針（環(huán)）稍事冷卻再取菌種，以免燒死菌種。
（4）取菌時(shí)注意菌落不要取得太多，應(yīng)蘸取而不宜刮取，否則平板劃線很難分離出單個(gè)菌落。
（5）平板劃線時(shí)注意掌握好劃線的力度和角度，用力不能過重，接種環(huán)和培養(yǎng)基表面大約呈30~40°角，劃線要密而不重復(fù)，充分利用培養(yǎng)基，并注意不能劃破平板。半固體培養(yǎng)基接種時(shí)注意穿刺線要直，并沿原穿刺線退出。
（6）接種完畢后，需在培養(yǎng)基上做好標(biāo)記再放置溫箱孵育。廢棄的有菌材料（如玻片、有菌的平板、試管、吸管等）均需**后再清洗。發(fā)生有菌材料污染應(yīng)及時(shí)進(jìn)行**處理。
三、**的培養(yǎng)方法
1．需氧培養(yǎng)法
該法適用于需氧菌和兼性***。將接種后的培養(yǎng)基（試管放試管架上，平板底上蓋下）置35℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)18-24h。大多數(shù)**生長速度快，在孵育18~24h后即可見到生長現(xiàn)象，但若標(biāo)本中的菌量少或生長速度慢的**（如結(jié)核分支桿菌），則需培養(yǎng)3~7天甚至4~8周后才能觀察到生長現(xiàn)象。
2．CO2培養(yǎng)法
（1）CO2孵育箱：能自動(dòng)調(diào)節(jié)箱內(nèi)CO2的濃度和溫度，使用方便。
（2）燭缸法：取一有蓋磨口標(biāo)本缸或玻璃干燥器，在蓋及磨口處上涂上凡士林。將接種后的培養(yǎng)基放入缸中，并在缸內(nèi)放一支點(diǎn)燃的蠟燭，加蓋密封。隨著缸內(nèi)蠟燭燃燒產(chǎn)生的CO2增加，蠟燭逐漸自行熄滅，此時(shí)缸內(nèi)的CO2濃度約為5~10%，置35℃培養(yǎng)箱孵育18~24h后觀察結(jié)果。（見圖4-7）
圖4-7 燭缸法
（3）化學(xué)法（重碳酸鈉-鹽酸法）：按每升容積重碳酸鈉0.4g與1mol/L鹽酸0.35ml比例，分別將二種試劑置于容器內(nèi)，將容器放置在標(biāo)本缸中，密封后傾斜容器，使二種試劑接觸混合產(chǎn)生CO2。該法適用于奈瑟菌和布魯菌等苛養(yǎng)菌的培養(yǎng)。
3．微需氧培養(yǎng)：先用真空泵將容器內(nèi)的空氣排盡，再注入5%O2、10%CO2、85%N2的混合氣體，然后置于35℃培養(yǎng)箱孵育后觀察結(jié)果。該法適用于空腸彎曲菌、幽門螺桿菌等微需氧菌的分離培養(yǎng)。
4．厭氧培養(yǎng)法：
（1）厭氧罐培養(yǎng)法：用理化方法使容器內(nèi)形成無氧環(huán)境，用于專性***培養(yǎng)。常用的方法有抽氣換氣法和氣體發(fā)生袋法。
1）抽氣換氣法：將已接種的培養(yǎng)基放入真空干燥缸或厭氧罐中，再放入催化劑鈀粒和指示劑美藍(lán)。先用真空泵將缸內(nèi)抽成負(fù)壓99.99kPa（750mmHg），再充入無氧氮?dú)?，反?fù)三次，*后充入80%N2、10%H2和10%CO2混合氣體，若缸內(nèi)呈無氧狀態(tài)，則指示劑美藍(lán)為無色。每次觀察標(biāo)本后需重新抽氣換氣，用過的鈀粒經(jīng)160℃2h干烤后可重復(fù)使用。
2）氣體發(fā)生袋法（Gas-pak法）：該法需以下二種容器：厭氧罐——是由透明聚碳酸酯或不銹鋼制成，蓋內(nèi)有金屬網(wǎng)狀容器，其內(nèi)裝有厭氧指示劑美藍(lán)和用鋁箔包裹的催化劑鈀粒；氣體發(fā)生袋——是一種鋁箔袋，其內(nèi)裝有硼氫化鈉-氯化鈷合劑、碳酸氫鈉-檸檬酸合劑各1丸和1張濾紙條，使用時(shí)剪去特定部位，注入10ml水，水沿濾紙滲入到二種試劑中，發(fā)生下列化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生H2和CO2。立即將氣體發(fā)生袋放入罐內(nèi)，密封罐蓋，使氣體釋放到罐中。
C6H8O7+3NaHCO3→Na3(C6H5O7)+3H2O+3CO2↑
NaBH4+2H2O→NaBO2+4H2↑
（2）厭氧袋法：厭氧袋是用無毒透明、不透氣的復(fù)合塑料薄膜制成。袋中裝有催化劑鈀粒和2支安瓿，分別裝有H2、CO2發(fā)生器（化學(xué)藥品，成分同上）、指示劑美藍(lán)。使用時(shí)將接種**的平板放入袋中，密封袋口，先將袋中裝有化學(xué)藥品的安瓿折斷，幾分鐘后再折斷裝有美藍(lán)的安瓿，若美藍(lán)為無色則表示袋內(nèi)已處于無氧狀態(tài)，置35℃溫箱孵育。
（3）需氧菌共生法：將已知專性需氧菌（如枯草芽胞桿菌）和待檢***分別接種到2個(gè)大小相同的平板上，將兩者合攏，縫隙用透明膠密封，置35℃溫箱培養(yǎng)，需氧菌生長過程中消耗氧氣，待氧氣耗盡后，***即開始生長。
（4）平皿焦性沒食子酸法：按每100ml容積加入焦性沒食子酸1g和2.5mol/LNaOH 10ml（也可用Na2CO3）的比例，先將焦性沒食子酸放入平皿蓋背面的**紗布中，再滴入NaOH，立即將接種**的平板扣上，用熔化的石蠟密封平皿和平皿蓋的縫隙，置35℃溫箱培養(yǎng)。
（5）庖肉培養(yǎng)基法：將庖肉培養(yǎng)基上面的石蠟熔化，用毛細(xì)管吸取標(biāo)本后接種于培養(yǎng)基中，待石蠟?zāi)毯笾?/span>37℃孵育。用于培養(yǎng)基中的肉渣可吸收氧氣，石蠟?zāi)毯笃鸶艚^空氣的作用，從而使培養(yǎng)基內(nèi)呈無氧狀態(tài)。
（6）厭氧手套箱培養(yǎng)法：厭氧手套箱是目前國際上公認(rèn)的培養(yǎng)****佳儀器之一。它是一個(gè)密閉的大型金屬箱，箱的前面有一個(gè)透明面板，板上裝有兩個(gè)手套，可通過手套在箱內(nèi)進(jìn)行操作。箱側(cè)有一交換室，具有內(nèi)外二門，內(nèi)門通箱內(nèi)先關(guān)著。使用時(shí)將物品放入箱內(nèi)，先打開外門，放入交換室，關(guān)上外門進(jìn)行抽氣、換氣（H2，CO2，N2）使之達(dá)到厭氧狀態(tài)，然后手伸入手套把交換室內(nèi)門打開，將物品移入箱內(nèi)，關(guān)上內(nèi)門。箱內(nèi)保持厭氧狀態(tài)，是利用充氣中的氫在鈀的催化下和箱中殘余氧化合成水的原理。該箱可調(diào)節(jié)溫度，本身是孵箱或?qū)⒎跸涓皆谄鋬?nèi)。該法適于作***的大量培養(yǎng)研究。
四、**生長現(xiàn)象的觀察
1．液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象：
渾濁生長（如葡萄球菌）、沉淀生長（如鏈球菌）、菌膜生長（如枯草桿菌）。
觀察要點(diǎn)：注意觀察培養(yǎng)基的透明度、管底和液面上是否有**生長。
2．半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象：
（1）無鞭毛的**：僅沿穿刺線生長，穿刺線清晰，周圍培養(yǎng)基透明（如葡萄球菌）。
（2）有鞭毛的**：沿穿刺線向四周擴(kuò)散生長，穿刺線邊緣呈羽毛狀，周圍培養(yǎng)基變渾濁（如大腸埃希菌）。
觀察要點(diǎn)：注意觀察穿刺線是否清晰、周圍的培養(yǎng)基是否混濁。
3．固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象：
菌落：由一個(gè)**生長繁殖而形成的一個(gè)肉眼可見的**集團(tuán)。因來源相同，同一個(gè)菌落的**為純種**。不同**菌落的形態(tài)學(xué)特征不同，可以鑒別**。
菌苔：由多個(gè)菌落融合而成，可能含有雜菌。
菌落性狀的描述：大小、形狀、顏色、凸扁、表面光滑度、濕潤度、光澤、透明度、邊緣、粘度、溶血（血平板）、氣味等。
【結(jié)果記錄和報(bào)告】
**的接種培養(yǎng)法與生長現(xiàn)象的觀察
**的接種培養(yǎng)法與生長現(xiàn)象的觀察
